### 细胞裂解液的制备

#### 一、试剂准备

1. 新鲜制备的冷RIPA裂解缓冲液：
- 150 mM NaCl
- 1% NP-40（去垢剂）
- 0.1% SDS（去垢剂）
- 2 μg/ml Aprotinin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
- 2 μg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂，使用前加入）
- 1 mM PMSF（蛋白酶抑制剂）
- 15 mM EDTA（蛋白酶抑制剂）
- 1 mM Na Vanadate（磷酸脂酶抑制剂，可选）
以上所有试剂均按比例溶解于150 mM NaCl溶液中。

2. 在冷PBS中加入：
- 1 mM PMSF
- 15 mM EDTA
- 1 mM Na Vanadate（钒酸钠，可选）

3. 对数期生长的细胞，使用至少3-4瓶75 cm²的培养瓶（生长面积超过90%）。

#### 二、实验步骤

1. 将培养瓶放置于冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够冷的PBS清洗细胞表面，以去除残留的培养基，倒掉PBS，并重复此操作2-3遍。在最后一次洗涤时，尽可能吸干残留的PBS。尽量在冰上操作。

2. 向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液（每75 cm²培养瓶加入1 ml），使用细胞刮刀沿瓶壁刮取细胞。如果有多瓶同种细胞需处理，可将第一瓶刮下的细胞液转移到下一瓶继续刮取。由于处理后的细胞裂解液较粘稠，建议使用直径稍大的吸液管进行操作。

3. 将刮好的细胞裂解液转移至置于冰上的14 ml离心管中，然后重复步骤2以刮取剩余的细胞。

4. 尽量将更多的细胞裂解液收集到14 ml离心管中，样品放入冰盒进行超声处理，超声强度应控制在不产生泡沫为准，每次超声2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应以10000 rpm离心10分钟，留取上清液。

5. 取少量细胞裂解液测定其蛋白浓度（使用Biorad Bradford试剂盒或紫外分光光度计在A280测定），并将样品分装保存于-70℃。

### 细胞裂解方法

细胞裂解可以通过物理或者化学方法实现：

#### 物理方法：

1. **反复冻融**：将细胞在-20℃和25-30℃环境下反复冷冻和解冻10-20次，适用于大部分哺乳动物细胞，如血细胞。

2. **煮沸法**：与冻融法相反，将细胞置于100℃沸水中煮5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。

3. **超声法**：将细胞放在超声破碎仪中，以适当频率进行超声处理，适用于绝大多数微生物细胞。

4. **渗透压法**：将细胞置于纯水等低渗溶液中，促使细胞吸收大量水分而破裂，适用于细胞膜较为薄弱的细胞，如血细胞。

5. **液氮法**：一般采用液氮捻磨的方法破解植物细胞。

#### 化学方法：

1. **强酸、强碱溶液**：如0.5 N NaOH溶液，通常能有效裂解绝大多数动物和微生物细胞。

2. **生物酶**：常使用溶菌酶或蛋白酶K等酶类来裂解微生物细胞。

在整个细胞裂解的过程中，选择合适的方法与试剂是确保后续实验成功的关键。无论是使用物理方法还是化学方法，[尊龙凯时]致力于为生物药物研究提供优质的技术支持与产品保障。