目的

学习利用尊龙凯时方法制备大肠杆菌感受态细胞。

原理

在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌会膨胀成球形，并可能失去部分膜蛋白，从而变得更加容易吸收外源DNA。

器材

实验所需器材包括旋涡混合器、微量移液取样器、移液器吸头、50ml微量离心管、15ml微量离心管、双面微量离心管架、台式冷冻离心机、制冰机、恒温摇床、分光光度计、超净工作台、恒温培养箱、摇菌试管、三角烧 flask 和接种环。

试剂

实验中使用的试剂有E. coli XL1-Blue、LB培养基、0.1mol/L CaCl2溶液，无菌去离子水(ddH2O)。

实验准备

在15ml离心管中装入铝制饭盒进行灭菌；将移液器吸头放入相应的吸头盒进行灭菌；平板培养基、LB培养基、冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液和无菌ddH2O均需灭菌；摇菌试管与三角烧 flask 也需进行灭菌处理。

操作步骤

1. 在超净工作台中，取一支无菌的摇菌试管，加入2ml的LB培养基（不含抗生素）。
2. 从超低温冰柜中取出XL1-Blue菌种，放置在冰上；使用烧红的接种环插入冷冻菌中，然后接入含2ml LB培养基的试管，37℃摇床培养过夜。
3. 取0.5ml上述菌液转接到含有50ml LB培养基的三角烧 flask 中，37℃，250r/min摇床培养2~3小时，测定OD600为0.375（<0.4~0.6，细胞数<10^8/ml，此为关键参数！）。以下操作将在超净工作台中进行，离心操作除外。
4. 将菌液分装至15ml预冷的无菌聚丙烯离心管中，放置在冰上10分钟，然后在4℃、5000rpm下离心10分钟。
5. 倾倒离心管以去除上清液，加入1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上混匀，然后放入冰中30分钟。
6. 在4℃、5000rpm下离心10分钟，弃去上清液，并用1ml冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液进行悬浮，再次在冰中放置30分钟。
7. 在4℃、5000rpm下离心10分钟，弃去上清液，用200μl冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液进行悬浮，使用超净工作台按照每管100ml的比例分装至15ml离心管中。这些样品可以直接用于转化实验，或立即放入-80℃超低温冰柜中保存（可存放数月）。
8. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦拭干净桌面。